Doctoral Program

◆ interim report 2021 




令和3年度大学院中間発表会が開かれました。
感染予防医学講座からは、大学院3年生の有木くん、
Eveさんが発表しました。今年は小林が当番世話人を勤めました。

 日時:令和2年9月1日(水) 8:55-19:10
 場所:臨床中講義室
 当番世話人: 小林 隆志


氏名:有木 晋平
所属:感染予防医学講座,消化器内科学講座
修学指導教員氏名:村上 和成、研究指導教員氏名:小林 隆志
演題目:T細胞特異的TRAF6欠損マウスを用いた腸管におけるnon-pathogenic-Th17細胞に関する研究
座長:寺西 仁志(神経生理学講座)・粂 慎一郎(病態生理学講座)

 【目 的】
 炎症性腸疾患の根本的原因は不明であるが、病態形成にヘルパーT細胞の一種であるTh17細胞の関与が報告されている。Th17細胞の産生するIL-17は、腸管においては保護的または増悪因子という両方の報告があり議論の余地がある。近年、Th17細胞には炎症性疾患を増悪させるpathogenic Th17細胞と炎症抑制に働くnon-pathogenic Th17細胞とに分類できることが報告されている。先行論文で、アダプター分子のTRAF6をT細胞で特異的に欠損するマウスでは、腸管おいてTh17細胞が増加し、実験的腸炎モデルであるDSS(dextran sulfate sodium)腸炎が軽減されることが報告されているが、それがいずれのTh17細胞の増減によるのかは不明である。そこで、DSS腸炎が軽減するのは、腸管で増加しているTh17細胞がnon-pathogenic Th17細胞であるためと仮説を立て、T細胞特異的TRAF6欠損マウスで腸管におけるnon-pathogenic Th17細胞の特徴をより明確にすることとした。

【方 法】
 野生型(WT群)およびT細胞特異的TRAF6欠損マウス(KO群)を用いて、DSS腸炎またはTNBS(trinitrobenzene sulfonic acid)腸炎を誘導する。DSSは2%にして飲料水に混ぜ自由飲水させ、5日目に水道水に変え、10日目に解剖する。TNBSは2mgを40%EtOHに溶解して単回注腸投与し、3日目に解剖する。体重および便の性状変化を連日記録する。結腸の長さを測り、近位、中間部および遠位結腸をホルマリン固定し組織学的に評価する。遠位結腸よりRNA抽出し、realtimePCR法にてサイトカイン発現量を測定する。Th17細胞はFACS解析で評価する。

【結 果】
 DSS腸炎では、先行論文のようにKO群で軽減されなかった。KO群のうち2匹で腸炎が悪化した。結腸の長さはKO群で短縮し、組織学的スコアもKO群で高値であった。しかしながら、KO群でIL-10が有意に高値であった。

【考察(問題点等を含む)】
 今回の実験では、KO群で腸炎が軽減されず、仮説と逆の結果となり、その先の解析がまだ実施できていないが、抗炎症性サイトカインであるIL-10の上昇がみられたので、これに注目して再現性を確認する。

【今後の計画】 
マウスを繁殖させてDSS腸炎を再試行予定である。TNBS腸炎も今後実施予定で、こちらは既報がないため表現型を確認し、免疫組織化学やFACS解析を行っていく予定である。

 

氏名:Thanyakorn Chalalai
所属:感染予防医学講座
修学指導教員氏名:花田 俊勝、研究指導教員氏名:小林 隆志
演題目:Physiological relevance of TRAF6 signaling in dendritic cells in controlling C. rodentium infection
座長:白石 裕士(細胞生物学講座)・松本 昂(環境予防医学講座)

【目 的】
Citrobacter rodentium (C. rodentium) has been used as a mouse infection model for studying human enterohaemorrhagic and enteropathogenic Escherichia coli (EHEC and EPEC). Upon ligation of pattern recognition receptors (PRRs), such as Toll-like-receptors by pathogen-associated molecular patterns (PAMPs), an intracellular molecule, tumor necrosis factor receptor-associated factor 6 (TRAF6) activates downstream signaling molecules required for inflammatory responses. However, physiological relevance of TRAF6 signaling in controlling C. rodentium infection remains unclear. Thus, we infected C. rodentium to dendritic cells-specific TRAF6-defifient (TRAF6D DC; CD11c-Cre Traf6 flox/flox) mice and analyzed the phenotype of the mice.

【方 法】
@ TRAF6D DC mice and wild-type (WT) mice were orally infected with 2 x 109 CFU of C. rodentium and monitored both survival rate and body weight changes. A Enumeration of the fecal and tissues bacterial load was performed after infection. B To assess the severity of the inflammation of the colon induced by C. rodentium infection, colon length was measured and, histological scores were calculated using H&E stained colonic tissue sections. C The expression levels of genes such as IL-12p40, IL-17 and IFN-γ which deeply correlated with both Th1 and Th17 responses in the colon were measured by real time PCR assay. D The population of Th17 cells and neutrophils in the colon were analyzed by flow cytometric analysis and immunohistochemistry, respectively.

【結 果】
@ TRAF6D DC mice showed body weight loss at 4 days post-infection (dpi), and started to die from 8 dpi, and approximately half of them survived. On the other hand, WT mice did not show body weight loss at all, and all mice survived. A An increased number of colonies was observed in the stool and colon of TRAF6D DC mice. B TRAF6D DC mice showed significantly shorter colon length, and higher histological scores than WT mice. C The expression levels of IL-12p40 and IFN-γ, but not IL-17 were reduced in TRAF6D DC mice. D In TRAF6D DC mice, both the number and proportion of Th17 cells were comparable with those of WT mice. Infiltration of neutrophils in the colon was rather enhanced in TRAF6D DC mice.

【考察(問題点等を含む)】
Here we found that TRAF6D DC mice were more susceptible to C. rodentium infection than WT mice. It has been reported that both Th1 and Th17 responses are important for the elimination of C. rodentium. In fact, bothIL-17, and IFN-γ-deficient mice were susceptible to C. rodentium infection. Given the decrease in IL-12p40, a common subunit of both IL-12 and IL-23, in TRAF6D DC mice, both Th1 and Th17 responses might be impaired in the mutant mice. Indeed, Th1 response as judged by increased levels of IFN-γ was impaired in TRAF6D DC mice. However, Th17 response as judged by IL-17 production was comparable between two groups and remarkable neutrophil infiltration was observed in the mutant mice. These results suggest that Th17 response inducing the recruitment of neutrophils is not sufficient for the eradication of C. rodentium.

【今後の計画】
To examine whether Th1 response inducing the activation of macrophages is responsible for the susceptibility to C. rodentium infection in TRAF6D DC mice, we well measure iNOS levels in macrophages using both immunohistochemical and flow cytometric analysis.