◆2015年の研究室配属

　妊娠時には過度な免疫応答を抑制する免疫細胞の作用が重要であるが、子宮に存在する自然免疫細胞群において、妊娠時の免疫抑制に重要な役割を果たす細胞群(サブセット)の同定は未だになされていない。そこで、妊娠時における子宮自然免疫細胞のミエロイド系マーカー分子発現パターンを解析し、妊娠の成立に重要な役割を果たすと考えられるサブセットの探索を試みた。マウスを未妊娠群、妊娠 5 日目群、妊娠 12 日目群 に分け５つのミエロイド系細胞群の割合をFlow Cytometry法で解析したところ、妊娠の経過によって大きく変動するサブセットがあることが明らかになった。このサブセットは、抑制系共刺激分子であるPD-L1, PD-L2の発現や、制御性T細胞の誘導に関連するといわれているCD103の発現が、未妊娠時に比べ上昇していた。さらに、免疫抑制性のサイトカインIL-10の発現も上昇しており、妊娠の成立や維持に重要な役割を担っている可能性が示唆された。今後、このサブセットの機能解析が重要である。

技術：マウスの取り扱い、Flow Cytometry法、RT-PCR法

　アニサキス症は、魚介類の生食後幼虫が胃壁に穿入して激しい腹痛を引き起こす疾患である（劇症型胃アニサキス症）。一方で、健康診断時等の内視鏡検査で、胃粘膜に穿入する虫体が偶然見つかる無症候例もある（緩和型胃アニサキス症）。しかし、症状の有無を規定する因子は未だ不明である。日本海側と太平洋側で異なるアニサキス種が分布するが、その種の違いによりアニサキス症を引き起こす能力に違いがあるのか議論されている。そこで、九州産サバ水揚げ地別の寄生アニサキス種の解析を行うこと、及び得られた虫体をもとに2種のアニサキス（Anisakis simlex s.s. 及びAnisakis pegreffii）幼線虫による1型アレルギー誘導能の違いを明らかにすることを試みた。

技術：PCR−RFLP法、マウス免疫実験、ELISA法

●　T細胞におけるTRAF6がEAEに与える影響
　　指導教員：神山、小林

　多発性硬化症は世界中で250万人以上の患者が罹患している免疫性神経疾患であるが、未だに決定的な治療法は確立されていない。多発性硬化症のマウス実験モデルとしてEAE (実験的自己免疫性脳脊髄炎)モデルが広く使用されているが、近年、ヘルパーT細胞（Th17細胞）が産生するIL-17がEAEの増悪因子であることが示された。一方、シグナル伝達分子TRAF6がT細胞で欠損するマウスは、全身性炎症疾患を自然発症することや、Th17細胞の分化が亢進することが報告された。しかし、T細胞のTRAF6欠損がEAE症状にどのような影響をおよぼすのか不明である。そこで、T細胞特異的TRAF6欠損マウスのEAEモデルマウスを作製し、その病態を解析したところ、予想に反して症状が軽減することが明らかになった。

技術：動物実験（マウス免疫）、RT-PCR法、FACS解析
　　　ELISA法 、病理学的解析

【感想】 今回の研究室配属で私は様々な実験手技を学べました。今回の研究テーマとは別の研究にも携わることができ、充実した二ヶ月を過ごすことができました。また基礎研究の仕事がどのようなものかを体験でき、将来を考える上で参考になりました。

【教授コメント】松岡くんは、将来基礎研究者になることも視野に入れ、私の講座を選んだそうです。 なるほど、いろんなことに興味をもち、探究心旺盛に果敢に挑戦。みんなから、親しみ込めて修造、修造と呼ばれてたのが印象的（テニスの松岡修造より）。研究にハマリすぎて、夢で実験動物に襲われて、思わずTh17（てぃえいちじゅうななっ）と叫んで目を覚ましたとか。今回の体験が、君の将来の糧になることを祈る！

　自己免疫疾患に関与するとされているIL-17を産生するヘルパーT細胞；Th17細胞の分化に必須の転写因子ROR-gtに結合する分子としてDGCR14が同定された。DGCR14は、先天性自己免疫疾患であるDiGeorge症候群の原因遺伝子の１つである。しかし、DGCR14欠損マウスは発生初期で死亡するため、個体での役割、特にT細胞における生理的機能は不明である。そこで、Cre-loxP部位特異的組み換えシステムを利用して作製されたT細胞特異的DGCR14欠損マウス (CD4-Cre DGCR14f/fマウス)を用いて、Th17分化におけるDGCR14の生理的機能の解析を試みた。

技術：動物実験（マウス免疫）、RT-PCR法、FACS解析

　リーシュマニア症は毎年１３０万人が新たに感染し２万人が死亡している原虫感染症であり、WHOの定義する顧みられない熱帯病 (NTD) の1つで、その研究は大変遅れている。リーシュマニア症の１つである内臓リーシュマニア症（別名：カラ・アザール）では、発熱、肝脾腫および貧血といった症状を示し、放置すれば死に至る。診断は骨髄液や肝臓における顕微鏡検査で原虫を証明することだが、侵襲的で検出感度も不十分である。また内臓リーシュマニア症は、時に治癒後にポストカラアザール皮膚リーシュマニア症（PKDL）と呼ばれる皮膚病変を形成し、本原虫のリザーバーとなり得ることが懸念されている。そこで、内臓リーシュマニア症の血液や皮膚病変から原虫を簡便かつ高精度で診断する方法の確立を目指し、Leishmania donovaniに対する乾燥LAMP法の確立を試みた。その結果、DNA精製が不要で、操作も簡便で、PCR法同様の高感度の乾燥LAMP法が確立できた。

技術：Dry-LAMP法、PCR法、細胞培養、原虫培養

【感想】今回２ヵ月の間感染予防医学講座に配属させていただき、基礎医学研究という学問に濃密に触れる機会を得ることができました。基礎医学の自分の疑問に素直になり、腰を据えて疑問解決に向けて結果を得ようとする探究する姿勢はまさに求道者そのもので刺激的なものでした。今後座学や病院実習を学ぶことはもちろん、疑問に思うことを見過ごさない姿勢でありたいと強く思った配属期間でした。５年後、１０年後基礎や臨床分野の中で自分の疑問を見つけて、たとえ答えが出なくてもサイエンスに取り組むことで先生方に顔向けできたらと思っています。今回は林田先生はじめ、感染予防医学講座ならびに動物実験部門のスタッフの皆様には大変お世話になりました。ありがとうございました。

【教授コメント】黒川くんのチューターとして一言。「よくここまで成長したな！」

●　Aedes (Stegomyia) scutellarisグループ蚊のチクングニアウイルスに対する感受性・媒介能の比較
　　指導教員：林田、小林

　 チクングニア熱は、アルファウイルス属のチクングニアウイルス (CHIKV)によって引き起こされ、発熱、関節痛、筋肉痛を主症状とする急性熱性疾患である。未だに有効なワクチンや抗ウイルス薬がなく、対症療法が主である。CHIKVはネックイシマカAedes (Stegomyia) aegyptiやヒトスジシマカ Ae. (Stg.) albopictusによって媒介されることでヒトヘの感染が成立する。しかし、日本に分布するヒトスジシマカの近縁種であるヤマダシマカ　Ae. (Stg.) flavopictusやリバーズシマカ Ae. (Stg.) riversiの媒介能については詳細な研究はなされておらず、これらヒトスジシマカ近縁種のCHIKVに対する感受性及びその媒介能を検討した。ウイルス液を１時間経口感染させ14間飼育した後、胴体と脚を分離しRT-PCR法にてCHIKVゲノムの検出を試みた。その結果、ヤマダシマカは高い感受性と媒介能を有することが示唆されたが、リバーズシマカの感受性は低いことが示唆された。

技術：蚊の飼育、RT-PCR法、細胞培養、ウイルス培養

●　大腸上皮細胞における抗菌ペプチド誘導の解析
　　指導教員：園田、小林

　大腸上皮細胞において様々なPAMPs (Pathogen associated molecular pattern)刺激によって発現が誘導される抗菌ペプチドをリアルタイムPCR法やWestern Blot法によって解析する。また、この発現誘導におけるTRAF6分子の役割を遺伝子組換え技術を用いて解析する。

技術：real time PCR法,Western Blot法，遺伝子組換え技術，遺伝子導入法，ゲノム編集（CRISPR-Cas9）